Mario en Luigi zijn twee loodgieters van Italiaanse afkomst. Jammer genoeg doet hun bedrijf het niet echt goed, maar wanneer Brooklyn onder water staat, schieten zij te hulp. Tijdens hun afdeling in de riolering komen zij terecht in een soort portaal. Mario wordt geteleporteerd naar het Paddestoelenrijk, en Luigi heeft meer pech, want die komt terecht in het Duisterrijk, waar kwade schildpad Bowser de plak zwaait. Die heeft een superster gestolen en is onderweg naar het Paddestoelenrijk met zijn duistere plannen. Mario ontmoet al snel Toad en prinses Peach, met wie hij niet alleen op zoek gaat naar zijn verloren broer, maar ook de strijd aangaat met de tiran.
Het verhaal, zoals je wellicht al kan lezen, is vrij luchtig gehouden en is bijna ondergeschikt aan de vele verwijzingen van de vele spelletjes. De deuntjes die we 30 jaar geleden hoorden komen hier op subtiele wijze binnen, en de film is ook een ode aan de vele platformelementen van de spelen. Neem daarbij nog een heus cartgegeven en een regenboogparcours en je weet dat fanservice voorop staat. Enkele bekende sterren zoals Jack Black, Chriss Pratt en Seth Rogen nemen de stemmen van de protagonisten onder hun hoede, wat zeker een meerwaarde is.